Идея химической точечной мутации

Идея химической точечной мутации фантастична. Тем не менее, ученые подошли к решению этой труднейшей задачи. Классическая генетика умеет вызывать даже на участок гена, может показаться мутации, но, как правило, эти довольно редкие события и изменения, которые вносятся в структуру ДНК, имеют случайный характер. Например, при выведении сорта семян удачные мутанты ищут годами, и число неудачных вариантов в каждом поколении растений может быть в тысячи раз больше, чем число удач. Заветная мечта генетиков — избирательное воздействие на отдельный ген, ведь это позволило бы, например, улучшить ферменты, создать направленный иммунитет, подавить работу генов, отвечающих за перерождение нормальной клетки в раковую.

Идея направленной химической «пули» основывается на том, что

[smszamok]

создается химический реагент, который не просто вызывает мутацию, а прежде узнает свою цель, узнает последовательность оснований, шифрующую определенный ген в молекуле ДНК.

В природе уже существует механизм узнавания — комплементарность. Вот типичный ее пример: два участка ДНК или участки ДНК и РНК узнают друг друга и располагаются так, что всегда против тими-на или у.рацила становится основание — аденин, напротив гуанина — цитоэин, и так далее. Они подходят друг другу, как две половинки застежки «молния».

Химия комплементарно адресованных реагентов — такое название получило это направление — начала развиваться в Новосибирском институте органической химии СО примерно 20 лет назад. В каждой нуклеиновой кислоте есть уникальная последовательность оснований, которая и может служить адресом для химической «пули». Основная часть адресованного химического реагента — олигонуклео-тид,— это небольшой фрагмент соединенных друг с другом азотистых оснований (нуклеотидов), где 10—20 оснований расположены в определенном порядке, так, чтобы они были комплементарны (соответствовали) нужному участку ДНК. В таком фрагменте одно звено (или несколько) химическим способом модифицируют — производят в нем родственную замену, Например, вместо атома водорода сажают Группу, содержащую атом хлора, а иногда вводят ароматическую группировку. Чаще всего подобные заместители вводятся в фосфатный остаток или же в. остаток сахара — рибозы. При этом фрагмент-нуклеотид остается вполне «узнаваемым» и в то же время Олигонуклеотид (цепочка из нескольких нуклеотидов), химически связанный с соединением платины, исследуется как противоопухолевый препарат направленного действия.

Уже синтезированы замещенные олигонуклеотиды и показано, что введенная в сахарный остаток группа СН2—СН2—С1 настолько видоизменяет его свойства, что этот фрагмент тормозит активность избранных участков на длинных молекулах рибосо-мальной РНК или на тРНК. Интересный результат наблюдали, когда в адресованный реагент, в химическую «пулю» вводили молекулу красителя (работа выполнена совместно с Институтом цитологии и генетики и Институтом автоматики и электрометрии Сибирского , отделения АН СССР). Краситель поглощает свет избирательно, только узкую область из всего видимого диапазона. Был выбран краситель, способный к двухквантовым переходам. Когда поток света от лазера проходил через кювету с раствором ДНК, адресованный реагент (с красителем) поглощал сразу два кванта света и молекула «пули» переходила в возбужденное состояние. Там, где находился адрес,— на участке ДНК, связанной с реагентом,— происходило расщепление полимерной цепи и этот участок ДНК выходил из строя. Таким образом можно, очевидно, подавить работу определенного гена.

Постепенно от химических этюдов исследователи получают возможность перейти к непосредственному решению ряда биологических задач. С помощью адресованного реагента уже удалось добиться направленной мутации одного из генов бактериофага Т7. Был создан направленный химический реагент, который регулировал активность тетрациклинового гена в плазмине бактерии. другими вирусами, и это явление известно давно. В 1957 году было обнаружено, что клетки, зараженные вирусом, выделяют в среду фактор устойчивости к вирусной инфекции— белки интерфероны. За прошедшие

четверть века были исследованы структура интерферонов, биосинтез этих белков в клетках, механизм их действия, биологические свойства и возможность использовать интерфероны в клинике для борьбы с вирусными заболеваниями человека.

Существует не одна, а три группы интерферонов. В организме их производят различные клетки; альфа-интерферон создают лейкоциты, бета-интерферон синтезируется при действии вирусов на клетки соединительной ткани, гамма-интерферон, который называют иммунным, образуется в Т-лимфоцитах. Все три типа интерферонов обладают разными физико-химическими свойствами.

Сейчас наиболее хорошо исследованы а ль фа-интерферон ы человека. Это целый класс — несколько белков; на соответствующих ДНК число генов, кодирующих синтез альфа-интерферонов, приближается к 20. Менее ясна ситуация с бета-интерферо-нами. Гамма-интерфероны представлены одним белком, которому соответствует один ген.

Интерфероны универсальны — они действуют на все типы вирусов, но в то же время проявляют видовую специфичность; для лечения людей нужны интерфероны, полученные из клеток человека Поэтому как медицинский препарат интер ферон был долгое время труднодоступным. Из одного литра донорской крови удавалось выделить только 1 мкг интерферона, а это примерно доза для одной инъекции.

Ситуация радикально изменилась, когда производство человеческого интерферона удалось осуществить с помощью микроорганизмов, сконструированных методами генной инженерии. Найти ген, отвечающий за синтез интерферона, оказалось очень трудной задачей. Сначала нужно было выделить РНК, на которой записана информация и Которая служит матрицей для рибосомы, где синтезируется белок. Привычно представление, что гены — это единицы наследственности в ДНК, но исследователи часто ночиноют поиски именно с РНК. На ней тоже есть информация о строении генов, и эта- молекула, как правило, много короче: РНК несет информацию только об одном гене или, во всяком случае, о небольшом числе генов. Выделив РНК, можно было получить соответствующую ей молекулу ДНК.

Нужно, однако, учесть, что в смесях РНК, которые выделяют из клеток (например, из лейкоцитов, производящих интерферон), нужной РНК содержится всего около 0,1%.

Чтобы создать бактерии для синтеза интерферона, исследователи использовали метод рекомбинантных молекул ДНК. В клетках бактерий, кроме хромосом, часто содержатся маленькие замкнутые в кольцо молекулы ДНК, так называемые плаэмиды. С помощью «молекулярных ножниц» — ферментов рестриктаз — плазмиду удается разрезать и затем, используя другие ферменты, вставить в нее фрагмент ДНК человека,— получить нужный молекулярный гибрид ДНК. Бактерии размножаются и размножают при этом встроенные в плаэмиды гены человека. Так получают «библиотеку генов» — собрание бактериальных клеток, в каждой из которых, кроме своих генов, содержится по крайней »лере один ген человека. В ней присутствуют самые разные гены человека, а нужен только один — ген интерферона.

Извлечь его из «библиотеки» очень сложно; решая эту задачу, исследователям

пришлось проанализировать около50000 бактериальных клонов (семейств), поистине это поиски иголки в стоге сена. Тем не менее ген интерферона удалось найти.

Однако трудности на этом не кончились. Ввести ген в плазмиду оказалось недостаточно, нужно было заставить его работать, заставить клетки кишечной палочки синтезировать чужеродный для нее белок. Успехи в решении этой конкретной задачи оказались связанными с более общими и принципиальными вопросами, в частности с выяснением того, ка« регулируется активность генов в клетках. Почему одного белка синтезируется мало, а другого много? Что служит сигналом для запуска гена? Как влияют условия среды на работу гена?

Синтез белка связан с двумя процессами. Первый — транскрипция: информация о строении гена переписывается с ДНК на РНК. Второй — трансляция: РНК в рибосоме программирует сборку белка. В активной работе гена в обоих случаях принимают участие регуляторные элементы, изучению которых особенно большое внимание придается в последнее время, Участки ДНК, которые предшествуют гену и много меньше его по размеру, получили название промоторов. Это своеобразные возбудители гена, необходимые для начала синтеза РНК. Очень важен для регуляции участок ДНК, который получил название сайт Шайн-Далгарно; он включается в цепь РНК и помогает рибосоме узнать место для начала синтеза белка. Заметьте — на карте ДНК, совсем как на географической карте, появляются названия в честь первооткрывателей.

[/smszamok]

В зависимости от структуры регулятор-ного участка один и тот же ген интерферона в одном случае может обеспечить синтез необходимого белка, в сотни и тысячи раз больший, чем в другом. Современная биотехнология добилась поразительных успехов, уже удалось получить такой искусственный штамм бактерий, что один литр бактериальной суспензии производит в тысячи раз большее количество интерферона человека, чем можно выделить из одного литра донорской крови.

Реферат подготовила В. СМИРНОВА.